利用病毒传递系统来转导细胞在基因和蛋白质研究已变得很常见，慢病毒载体就可以稳定地表达目的基因。慢病毒，属于逆转录病毒，它的主要作用机制是表达逆转录酶，将表病毒的RNA转化为双链DNA，整合酶再将病毒DNA插入宿主DNA，然后和宿主细胞一起进行分裂。慢病毒可以感染分裂细胞和非分裂细胞，如有丝分裂后的细胞。

在细胞相关的实验操作中，对于一些按照常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。

一、概述

我们都知道，病毒缺乏复制机制，所以需要细胞来“存活”。慢病毒载体传递系统最重要的一个方面就是慢病毒载体的生产，通常在293T细胞。

例如，慢病毒传递系统的一个常见用途是插入短的发夹RNAs (shRNA)，用于RNAi介导的基因敲除。shRNA首先被包装成慢病毒载体，然后转染293T细胞。转染的细胞孵育约3天，此间慢病毒复制和产生慢病毒颗粒，然后收获，评价滴度，再转化目标细胞。

病毒转染包括以下步骤：1构建载体 2包装提纯病毒 3感染靶细胞。

二、关于慢病毒载体构建的原理

慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成，及包装成分和载体成分。包装成分由HIV-1基因组去除了包装，逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所徐的蛋白；载体成分则与包装成分互补，及含有包装，逆转录和整合所需的顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点上插入目的基因。将包装成分与载体成分的多个质粒共转染包装细胞，即可在细胞上清中收获携带目的基因的复制缺陷型慢病毒载体颗粒。

 慢病毒表达载体包含了包装，转染，稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞进中行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。

三、关于转染293T细胞

维持细胞的良好状态是必要的。293T细胞生长迅速，胰蛋白酶化速度快，所以不要在胰蛋白酶中长时间孵育，否则可能会有大量细胞死亡。解冻后的细胞应至少传代两次，然后接种进行转导实验。并且要非常轻柔地处理，因为细胞很容易分离。在转染实验中，293T细胞接种于约6-8*10^6细胞/10cm培养皿中，接种后次日细胞约70-80%融合。

四、为转导做好准备

将慢病毒载体质粒连同病毒包装载体打包成脂质体，并将其递送到293T细胞中。在实验的包装部分使用无血清培养基是非常重要的。无血清培养基促进DNA与阳离子脂质体复合物的形成，提高转染效率。

有了转染复合物，含shRNA、包装质粒和脂质体，就可以进行包装了。倾斜带有293T细胞的培养皿，将转染混合物逐滴加入收集的培养基中。在添加转染混合物时要谨慎，温柔操作。一旦加入溶液，小心地旋转平板，使培养基混合，将转染混合物均匀地分配到细胞上。

在无血清培养基中培养4-6小时。孵育后，轻轻抽吸培养基(这将包含没有转染293T细胞的含有质粒的脂质体)，并在培养皿的一侧加入10 ml完全培养基，这样细胞就不会分离。293T细胞将shRNA包裹成病毒颗粒并释放到培养基中。

此时，培养基中会充满病毒颗粒，因此在搬运时应穿戴适当的防护用品。48小时后收集培养基(病毒颗粒)，将10 ml新鲜的完全培养基加入同一培养皿中。72小时后再次收集培养基，与48小时收集的结合。通过0.45微米的过滤器对收集到的混合培养基进行消毒，以允许病毒通过。冻融循环会降低病毒的效力，所以最好进行分装。病毒可以在4℃下保存一到两个月，长期保存在-20℃。经常使用漂白剂处理在病毒产生过程中使用的吸管头和平板。

五、 关于慢病毒转染细胞的实验方法

Ⅰ、慢病毒转染贴壁细胞实验方法
1、慢病毒转染前18-24小时，将贴壁细胞以1×10^5/孔铺到24孔板中。使细胞在慢病毒转染时的数量为2×10^5/孔左右。
2、第二天，用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鲜培养基替换原培养基，加入适量病毒悬液。37℃孵育。
3、（对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤）4小时后加入2ml新鲜培养基以稀释polybrene。
4、继续培养24小时，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。
5、继续培养。如果慢病毒含有荧光蛋白，一般转染48小时后可见明显荧光表达，72小时后更加明显。如需FACS检测转染效率，可在转染后72-96小时进行。如果慢病毒含有抗性基因并且需要加药筛选，可以在转染3-4天后开始加药。

Ⅱ、慢病毒转染悬浮细胞实验方法
1、在2×10^5/ml悬浮细胞中加入polybrene至6 μg/ml和适量病毒，充分混匀。37℃孵育。或者150g室温离心4小时（选作，部分难转染的细胞系采用此步骤可以提高转染效率）。
2、（对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤）4小时后（或离心结束后）加入等体积新鲜培养基以稀释polybrene。
3、继续培养3-4天。中间视细胞生长情况可传代或换液。

慢病毒感染Hela细胞的图片：