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- 产品简介
酪酰胺信号放大(TSA，Tyramide signal amplification)技术是一类利用辣根过氧化酶（HRP）对靶蛋白进行标记的酶学检测方法，TSA实验原理是利用酪胺Tyramide的过氧化物酶反应（酪胺盐在HRP催化下形成共价键结合位点)，产生大量的酶促产物，该产物能与周围的蛋白残基（包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基）结合，这样在抗原-抗体结合部位就有大量的荧光素沉积，使其检测信号得到10-100倍增强。
TSA多重免疫荧光是利用二抗上带有的HRP（而不是直接偶联荧光素），来催化后续添加入体系的非活性荧光素。荧光素在HRP和H2O2的作用下被活化，跟临近蛋白的酪氨酸残基共价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定结合。然后通过微波、煮沸、水浴等热修复处理，非共价结合的抗体被洗掉，共价结合的荧光素稳定结合在样本切片蛋白上。再换另一个一抗来进行第二轮孵育，周而复始。等所有抗体孵育结束，荧光素都结合好后，再检测结果。
由于每次体系中都只有单一抗体孵育，因此无需担心抗体交叉反应，以及一抗二抗种属匹配问题，大大减少了实验设计时不同种属抗体选择匹配的限制。也就是说，使用TSA技术，同一张片子上所有的靶标都可以选用特异性高的兔单克隆抗体。搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以进行实验。本公司开发的试剂盒所使用的酪胺荧光染料可单独或配合使用以实现单标、双标、三标及更多重荧光放大/多重同源抗体荧光标记等功能。
荧光光谱数据
产品组分及配制\
* 以下试剂建议现配现用，用多少配多少
荧光染料工作液配制：将TSA荧光激活剂与FH-XXX荧光试剂按1:100的比例充分混匀后使用
二抗工作液配制：将Polymer-HRP山羊抗鼠/兔二抗与抗体稀释液按1:200的比例充分混匀后使用
使用方法以下说明以石蜡切片样本为例：
1.样本准备：依次将切片放入二甲苯Ⅰ 10min - 二甲苯Ⅱ 10min - 无水乙醇Ⅰ 5min - 无水乙醇Ⅱ 5min - 95%乙醇 5min - 85%乙醇 5min - 75%乙醇5min，水洗待用。
2.阻断内源性过氧化物：切片放入3%过氧化氢溶液，室温孵育10min，以封闭内源性过氧化物酶。封闭完成后将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3.抗原修复：组织切片置于盛满PH9.0 EDTA抗原修复液或者PH6.0柠檬酸修复缓冲液的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，依次经过中火8min，停火5min，转低火5min，此过程应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片（也可以用高压1-2min或100°C水煮15min等其他热修复方法）。自然冷却后将玻片取出，置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min（修复液和修复条件根据组织类型以及抗原类型来确定）。
4.BSA封闭：切片平放于避光湿盒内，稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内滴加100-200µL的5% BSA封闭液（或者与二抗同一来源血清，如山羊血清等其他封闭液）均匀覆盖组织，湿盒内加少量水防止抗体蒸发，37℃封闭30min。
5.加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加稀释好的一抗，4℃孵育过夜或者37℃孵育1-2h（4℃过夜后第二天需将切片置于37℃复温30min）。
6.加二抗：切片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗种属连接的Polymer-HRP二抗，覆盖组织，37℃孵育30min。
7.荧光染料反应：切片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片甩干，在圈内滴加50-100µL的FH-520荧光染料工作液，室温避光反应10min。标记完成后，切片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
8.重复步骤3-7进行第二轮标记（步骤5换用第二种一抗，步骤7用FH-580荧光染料工作液标记）。
9.重复步骤3-7进行第三轮标记（步骤5换用第二种一抗，步骤7用FH-620荧光染料工作液标记）。
10.复染细胞核：切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，室温避光孵育10min。
11.封片：切片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
12.镜检拍照：切片于荧光显微镜/共聚焦/多通道荧光扫描仪/多光谱成像系统下观察并采集图像。
以下说明以细胞爬片为例：
1.样本准备：依次将切片放入二甲苯Ⅰ 10min - 二甲苯Ⅱ 10min - 无水乙醇Ⅰ 5min - 无水乙醇Ⅱ 5min - 95%乙醇 5min - 85%乙醇 5min - 75%乙醇5min，水洗待用。
2.阻断内源性过氧化物：切片放入3%过氧化氢溶液，室温孵育10min，以封闭内源性过氧化物酶。封闭完成后将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3.抗原修复：组织切片置于盛满PH9.0 EDTA抗原修复液或者PH6.0柠檬酸修复缓冲液的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，依次经过中火8min，停火5min，转低火5min，此过程应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片（也可以用高压1-2min或100°C水煮15min等其他热修复方法）。自然冷却后将玻片取出，置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min（修复液和修复条件根据组织类型以及抗原类型来确定）。
4.BSA封闭：切片平放于避光湿盒内，稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内滴加100-200µL的5% BSA封闭液（或者与二抗同一来源血清，如山羊血清等其他封闭液）均匀覆盖组织，湿盒内加少量水防止抗体蒸发，37℃封闭30min。
5.加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加稀释好的一抗，4℃孵育过夜或者37℃孵育1-2h（4℃过夜后第二天需将切片置于37℃复温30min）。
6.加二抗：切片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗种属连接的Polymer-HRP二抗，覆盖组织，37℃孵育30min。
7.荧光染料反应：PBS晃动浸洗3次，每次5min。滴加100-200µL的FH-520荧光染料工作液，室温避光反应5-15min。标记完成后，PBS晃动浸洗3次，每次5min。
8.抗体洗脱：滴加1mL 37℃预热至完全溶解的抗体洗脱液，37℃孵育5-20min，弃去洗脱液，再次滴加适量抗体洗脱液覆盖样本，37℃孵育5-20min，弃洗脱液，PBS浸洗3次，每次5min。
9.重复步骤4-8进行第二轮标记（步骤5换用第二种一抗，步骤7用FH-580荧光染料工作液标记）。
10.重复步骤4-7进行第三轮标记（步骤5换用第三种一抗，步骤7用FH-620荧光染料工作液标记）。
11.复染细胞核：切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，室温避光孵育10min。
12.封片：切片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
13.镜检拍照：切片于荧光显微镜/共聚焦/多通道荧光扫描仪/多光谱成像系统下观察并采集图像。
注意事项1.开始实验前，应仔细阅读此说明书。
2.FH-XXX荧光试剂在-20℃下均为固态，使用之前需解冻。首次解冻后可选择将荧光试剂进行分装，避免试剂反复冻融。
3.在加入荧光染料反应后，后续步骤均要注意避光处理。
4.荧光染料的使用顺序不受限制，可根据需要自由选择。
5.如荧光背景信号较强，建议增加组织自发荧光淬灭步骤。
6.避免试剂接触眼睛和粘膜，如接触到敏感区域，立即用大量清水冲洗。
7.本试剂仅用于科学研究，不作其他用途。
案例展示如您有任何定制方案需求，请点击咨询在线客服或拨打400-000-7085
