基因敲除KO细胞株构建服务
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技术背景
Technical background
丰晖生物的敲除稳株是利用CRISPR/Cas9技术，通过RNP（核糖核蛋白复合物）法针对常见细胞系进行基因敲除改造的服务。CRISPR/Cas9敲除细胞系广泛应用于肿瘤相关基因研究、遗传疾病治疗、动植物转化研究等领域。
CRISPR/Cas9来源于细菌的适应性免疫系统，科学家将其改造成为一种高效、精准、便捷且成本低廉的基因组编辑工具。CRISPR/Cas9表达出sgRNA和Cas9蛋白，并形成RNA-蛋白复合物，随后sgRNA引导Cas9蛋白对靶基因进行切割，造成DNA双链断裂，随后触发细胞内的NHEJ或HDR修复机制，其中NHEJ为主要的修复途径，可以快速完成DNA的修复，但是会在修复时引入随机的突变（碱基的插入或缺失等），使DNA发生移码突变，从而实现靶基因功能缺失的目的。
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丰晖生物拥有自己的基因库和细胞库，实验室具备多年的基因编辑和细胞培养经验，我们会针对靶基因PAM上游片段设计sgRNA，构建基因敲除载体，制定专属实验方案对目的细胞进行改造，最终交付给您满意的基因敲除稳株。
技术优势
Technical advantages
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丰晖生物细胞库拥有各种种属等千余种细胞系以及原代细胞，基因库包含10万余种各种属基因，满足多种实验需求。
丰晖生物技术平台完善，有细胞平台、分子平台、病毒平台等多个平台，实验经验丰富，可为客户订制 专属的敲除方案。
我们构建了自己的基因编辑功能细胞库，并在持续扩库，能够为客户提供多种功能细胞株进行选择，有效缩短实验周期。
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我们优化了CRISPR/Cas9系统，大大降低了脱靶率，提高实验成功率。
技术原理
Technical Principles
稳株构建流程
Stable plant construction
交付标准
Delivery standards
案例展示
Case presentation
【1】NIH3T3细胞SMN1敲除单克隆稳株
【2】A549细胞ACSL4基因敲除双重保障型单克隆稳株
常见问题解答
【1】什么是条件致死？
敲除致死的基因通常为细胞生命活动的“核心基因”，其敲除会直接导致关键生理过程（如胚胎发育、能量代谢、细胞分裂）的彻底失败。敲除致死的主要原因可能有：（1）该基因是细胞或生物体存活的“必需基因”，其编码的产物（如关键酶、结构蛋白、调控因子等）是生命活动的基础；（2）某些基因的功能依赖于产物的精确剂量，剂量不足会直接导致关键生理过程失败；（3）杂合子中的敲除等位基因可能编码异常产物，该产物会干扰正常等位基因产物的功能，导致整体功能丧失；（4）单倍体不足是指单个正常等位基因无法维持正常表型，即杂合子（+/-）的功能已不足以支持生存。
【2】最后交付的到底是STR鉴定报告还是种属鉴定报告呢？
如果使用我司人源/部分小鼠细胞系进行敲除稳株构建，则默认提供STR鉴定报告；若使用无STR鉴定位点的细胞，则默认提供种属鉴定报告。
【3】多克隆KO株交付的测序结果为什么显示是套峰/杂峰？
目的基因的扩增产物会包含多种不同的基因序列（正常序列、不同的敲除/突变序列）。测序时，这些不同序列在同一位置会显示多个碱基信号叠加，表现为套峰（同一位置出现两个或多个峰）或杂峰（背景杂乱的峰）。
【4】为什么基因层面100%敲除了，但是WB结果显示没有明显的变化？
基因的消失与蛋白表达/功能的消失存在不完全对应关系，常见的原因有以下几类：
（1）当代基因编辑技术的局限性——密码子的简并性与移码突变的不完全性
基因敲除技术可能仅造成小范围移码，但若突变发生在基因的非关键区域（如靠近3'端），剩余的氨基酸序列仍可能折叠成部分功能的蛋白；或终止密码子延迟出现，虽使蛋白质变短，但仍具有活性。
（2）细胞内复杂的代偿或修复机制
mRNA的降解逃逸：正常情况下，基因移码突变的 mRNA 会被细胞的无义介导降解（NMD）机制清除，但部分突变 mRNA可能逃逸降解，翻译出截短蛋白，导致WB检测仍有条带，表现为比目标分子量更小的条带。
代偿机制的存在：某些基因的功能可被同源基因代偿，即使目标基因蛋白消失，表型也可能无明显变化；代偿基因未能激活，蛋白缺失的表型才会显现。
翻译后修饰的影响：即使基因敲除导致蛋白表达量下降，残留的少量蛋白仍可能通过磷酸化、甲基化等修饰维持部分功能，导致基因敲除成功但蛋白功能未完全丧失的现象。
（3）部分细胞（如癌细胞）的基因组混乱
癌细胞基因组通常存在多拷贝基因、染色体异质性、基因结构变异等特征，可能导致基因敲除后仍能检测到目标蛋白。这种现象反映了癌细胞的高度适应性和基因组可塑性，也是癌症治疗中靶向治疗耐药的重要原因之一。
（4）解决方法
结合多层面验证：基因测序确认敲除成功后，需通过 Western blot、免疫荧光（IF）等技术手段验证蛋白表达及空间定位的变化，同时结合功能实验（如细胞表型、信号通路变化）综合判断基因功能是否确实缺失。
总的来说，基因层面的敲除成功是功能研究的基础，但蛋白水平的变化受多种调控机制的影响，因此实验中需基因测序与蛋白检测、功能验证相结合，才能更严谨地判断基因敲除的实际效果。基因编辑并非总能完全阻断蛋白功能，这正是后续功能验证的意义所在。
或拨打400-000-7085
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