恶性肿瘤是医学的难题，肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性是目前临床肿瘤治疗失败的主要原因，成为了目前阻碍肿瘤研究的最大困难。

一般认为，肿瘤细胞耐药主要受蛋白介导的药物外排泵机制、酶介导机制和凋亡调控基因介导机制等控制。

耐药株机理

肿瘤细胞对多种药物产生耐药的原因相当复杂。

肿瘤细胞的耐药可通过很多机制来实现，如细胞膜上的转运蛋白（如ABC转运蛋白和 P-gp 蛋白），以及高表达耐药基因（如MDR1 基因与 MRP 基因），或通过 DNA 损伤修复及抑制细胞凋亡等途径。由多药耐药基因引起的耐药只是其中一种，这种基因产物是一种膜糖蛋白，它一旦与抗肿瘤药物结合，通过ATP提供能量，可以将药物泵出胞外，使细胞内药物浓度下降，从而表现出耐药现象。目前发现许多肿瘤耐药细胞具有肿瘤干细胞特性，如人结肠癌 HT29 耐药株、卵巢癌 OVCAR-3、乳腺癌MCF-7、肺癌 H460 等。肿瘤干细胞学说认为，肿瘤细胞起源于肿瘤干细胞，肿瘤干细胞具有自我更新、多向分化、恶性程度高等特点，肿瘤干细胞是肿瘤耐药的主要原因。

肿瘤细胞对化疗药物产生耐药是目前导致临床化疗失败的主要原因，成为目前阻碍肿瘤治疗的绊脚石。因此，探索肿瘤细胞产生耐药的原因以及如何改善肿瘤细胞对化疗药物耐药仍是目前研究的热点和难点。肿瘤细胞耐药的产生是一个复杂的过程，它的机制广泛牵涉到药物代谢学、病理学、生理学等多个学科，这就决定了肿瘤细胞对化疗药物产生耐药的机制是复杂的，因此体外建立化疗药物耐药细胞株仍然是研究肿瘤细胞耐药机制的重要方法。

耐药株建立方法

体外建立肿瘤细胞耐药模型是研究肿瘤多药耐药（MDR）的重要手段。目前已知的体外建立耐药细胞株主要有以下几种方式：大剂量药物冲击法、药物浓度递增法、药物浓度递增与大剂量药物冲击相结合法、转基因结合药物筛选法，也有人采用逆转录病毒转染法。

目前已经在多种肿瘤中建立了耐药模型，如肝癌、结肠癌、乳腺癌等。其中药物浓度递增法和大剂量药物冲击法成为临床建立肿瘤细胞化疗耐药模型的常用方法。

而这两种方法各有优缺点：

药物浓度递增法

优点：诱导耐药细胞的药物剂量循序渐进，细胞培养的外环境逐渐改变，细胞较易耐受，状态较好。

缺点：诱导耐药过程耗时很长，且其化疗药物的作用方式与临床上化疗药物大剂量短疗程的化疗原则存在一定的差异。

大剂量药物冲击法

优点：是与临床上大剂量化疗药物冲击的治疗的化疗方式相接近

缺点：大剂量药物冲击法的药物浓度很高，细胞培养外环境骤变，细胞可能难以耐受，细胞状态较难控制，且耐药性能不稳定。

利用药物浓度递增法和大剂量药物冲击法建立的两种耐药细胞株在细胞形态和生物学特性上都有很大的差别，属于不同的细胞亚系。药物大剂量冲击法建立耐药细胞株的方法与临床化疗治疗的给药方法相似。

在临床治疗给药中，为了最大减轻化疗药物的毒副作用，最常用的治疗方式就是大剂量短程给药。通过比较两种方法建立的相应耐药株的生物学特性及耐药相关蛋白表达的变化，得到的实验结果提示药物大剂量冲击法建立的耐药模型更接近临床化疗耐药的实际情况，为后续逆转肿瘤细胞耐药的研究提供基础。

评价方法

建立模型的评价方法主要有以下两种：耐药倍数的检测；耐药相关蛋白的检测。

MTT、 CellTiter-Glo 发光法（CTG）测定药物对亲本细胞和耐药细胞的IC50，计算耐药指数(RI)。

用 SPSS 软件计算半数抑制率（IC50）值，根据IC50值计算出耐药指数（resistance index, RI），RI=耐药细胞系的IC50/亲代细胞系的IC50，RI>5则认为耐药细胞系的耐药性符合耐药株的要求。

WB、PCR、流式细胞、免疫学等多项方法检测耐药相关蛋白的表达情况。常用作检测指标的耐药相关蛋白主要有P-糖蛋白（P-gp）、多药耐药蛋白1（MDR1）。MDR发生的机制十分复杂，其中，多药耐药基因MDR编码的P-糖蛋白高表达是耐药的主要机制。

MTT法检测耐药细胞株IC50（22RV1 IC50=7.16μg/ml；22RV1-DDP IC50=40.49μg/ml，RI=5.65）。

MTT法检测耐药细胞株IC50（HCT-8 IC50=2.65 μg/ml；HCT-/Fu IC50=52.11 μg/ml，RI=19.66）。

22RV1细胞

22RV1-DDP

HCT-8细胞

HCT-8/Fu

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